功能性低聚糖由于其獨特的生理功能已被廣泛應用于食品工業和飼料工業，而低聚木糖由于在理化性質、生物活性及使用量等方面的優勢而倍受關注。此外，低聚木糖在醫藥（藥品監管制度的重要性）工業和農業等領域也具有較廣闊的應用前景。

　　目前，在研究開發低聚木糖產品時存在兩個難題：一是缺乏低聚木糖單一組分的分析標準品；二是缺乏低聚木糖單一組分用于其生物活性的研究。解決這兩個問題有助于制備分離出低聚木糖單一組分。南京林業大學在低聚木糖的分離和純化方面已有研究，筆者對凝膠過濾層析分離低聚木糖的規律和特點進行了研究，以期為今后大量制備分離低聚木糖單一組分提供理論依據。

　　1材料與方法

　　1.1試材

   　低聚糖由南京林業大學生物化工研究所提供。玉米芯經木聚糖酶定向降解后，經過一系列分離、提純得到了含有不同聚合度低聚木糖組分和一定雜質的粗低聚木糖混合液。聚丙烯酰胺凝膠介質BioGelP4和BioGelP2均購自BioRad公司。　　     1.2低聚木糖的分離在洗凈的3.0cm120cm層析柱頂端接上漏斗，關閉柱下端出口，調整柱溫到48，加入相當于柱體積20的脫氣超純水。將經潤脹并已除去細小顆粒的凝膠BioGelP4懸浮液沿柱壁緩緩加入層析柱，填充過程中要避免懸浮液濺起而產生氣泡。

　　層析柱裝填好后接上蠕動泵、自動收集器和超級恒溫水浴槽進行層析柱的平衡。分離時吸取一定量經濃縮的低聚木糖液均勻滴加在凝膠表面，當糖液剛好進入凝膠表面后打開底部閥門，啟動蠕動泵開始洗脫，同時打開下端閥門，當快要出糖時開始收集，每管收集3.6mL，采用DNS法直接測定各管收集液的還原糖含量。

　　低聚木糖的二次分離是在快速蛋白質液相層析系統（AKTAFPLC系統，Pharmacia公司生產）中完成的。層析柱為XK16/100，層析介質為BioGelP2，其裝填方法和上述過程相似。以脫氣超純水洗脫，柱溫48，采用280nm紫外線和示差折光檢測器同時檢測。

　　1.3分析方法（1）還原糖濃度的測定采用DNS（3，5二硝基水楊酸）法。

　　（2）低聚木糖的分析采用高效液相色譜（HPLC）法。其中木二糖標準樣品購于Sigma公司，聚合度大于2的低聚木糖組分的含量按木二糖標準方程近似計算。

　　（3）糖基組成的分析。取一定體積的樣品溶液于50mL三角瓶中，加入等體積的8H2SO4，在121下水解60min，用NaOH溶液將水解液中和至pH為6.57.0，以WatersSugarpakTM為分析柱，在WatersHPLC246E高效液相色譜上對水解液中的阿拉伯糖和木糖進行分析，其質量之比即為糖基比。

　　2結果與分析

　　2.1BioGelP4分離的還原糖濃度

　　為制備分離低聚木糖單一組分，同時了解低聚木糖單一組分的結構特點，以BioGelP4為層析介質對低聚木糖混合液進行了分離。脫氣超純水洗脫，柱溫48，每管收集3.6mL.

　　最后對每管收集液采用DNS法測還原糖含量，收集樣品號和還原糖濃度的關系見圖1.直接測定各級分還原糖含量可初步判斷經分離的各組分，即將粗低聚木糖混合液至少分成5個組分。由于該低聚木糖混合液中木二糖含量較多，因此推測組分1為木二糖組分。根據凝膠過濾層析按分子量大小依次分離各組分的原理，可以推測組分2為木三糖組分，后經電噴霧電離質譜分析證實了此推測。

　　2.2分離組分的特性分析

　　將4246號、3740號、2528號、1822號和1415號樣品（分別對應組分1至組分5）分別合并，然后對各峰合并液進行HPLC分析，同時對各組分酸解后進行糖基組成分析，其中低聚木糖各組分的認定依據AminexHPX-42A分析柱特點和木二糖、木糖、阿拉伯糖標樣。

　　組分1為純度較高的木二糖，純度高達98.18，阿拉伯糖基與木糖基之比僅為0.012，微量的阿拉伯糖來自于組分中混有的阿拉伯單糖，故木二糖中不含阿拉伯糖基。組分2的HPLC分析圖譜中最高峰為木三糖峰，計算結果表明，組分2中木三糖純度為88.54.該組分中阿拉伯糖基與木糖基之比為0.025，微量的阿拉伯糖基可能來源于其中未完全分離的阿拉伯單糖，故木三糖組分不含阿拉伯糖基。根據凝膠過濾層析原理，木四糖應在木三糖之前被洗脫出來，可能是由于木四糖含量較少，在3135號樣品中只檢測到微量的還原糖，據此推測組分3應為木五糖組分，電噴霧電離質譜分析證實了此推測。

　　組分3的HPLC分析圖譜的峰型極不對稱，這可能是因為該組分中含有帶阿拉伯糖基側鏈的低聚木糖同分異構體（即異質低聚木糖）。組分3中的阿拉伯糖基與木糖基之比為0.135，即阿拉伯糖基含量為11.89，其阿拉伯糖基含量明顯高于組分1和組分2.由于阿拉伯糖單糖滯后于木五糖洗脫出來，故組分3酸解液中大量的阿拉伯糖不可能來自阿拉伯糖單糖，而是來自木五糖組分中所含的阿拉伯糖基側鏈，因此組分3應為混有帶阿拉伯糖基側鏈的木五糖同分異構體。由于它們分子量相等，因此采用凝膠過濾層析無法完全分離。根據前面分析可以得出，組分4和組分5分別為木六糖和木七糖組分，HPLC分析表明，其純度分別達到78.80和86.67，兩組分的阿拉伯糖基與木糖基之比分別為0.102和0.300，這說明組分4與組分5中也不同程度含有阿拉伯糖基側鏈，其中木七糖組分中含較多阿拉伯糖基側鏈。

　　分別對應木二糖至木七糖；糖基比為阿拉伯糖與木糖質量比。

　　對各組分的HPLC分析可以看出，采用聚丙烯酰胺凝膠BioGelP4對粗低聚木糖混合液一次分離，可以得到純度不等的低聚木糖單一組分。

　　由于木五糖至木七糖含有帶阿拉伯糖基側鏈的同分異構體，因此不能采用凝膠過濾層析的原理分離獲得標準品。該酶解法制備的低聚木糖中所含的木二糖和木三糖不含阿拉伯糖基，可采用二次上柱分離的方法進一步提高木二糖和木三糖組分的純度。

　　2.3木三糖組分的二次分離為了證實采用二次分離工藝提高低聚木糖單一組分純度的有效性，試驗以聚丙烯酰胺凝膠BioGelP2為層析介質，以AKTAFPLC為控制系統對木三糖組分的濃縮液進行了二次分離。

　　可以看出，以BioGelP2為層析介質可將木三糖組分分成多個組分，其中洗脫體積在50115mL的組分峰型不對稱且280nm紫外線吸收較強，因此該組分為非糖雜質。洗脫體積介于115140mL的圖譜峰型和木三糖組分的HPLC圖譜相似，因此洗脫體積125mL處為木三糖峰。將此峰收集合并后進行HPLC分析，表明木三糖含量為94.19.說明BioGelP2可將木三糖組分中少量的木二糖和木三糖分離開來，并將木三糖組分的純度從88.54提高到94.19.因此，采用二次分離的工藝能進一步提高混合液中木三糖組分的純度，從而獲得大量高純度的木三糖組分。

　　3結論

　　（1）以聚丙烯酰胺凝膠BioGelP4為層析介質，可將低聚木糖液至少分成5個組分，得到的木二糖、木三糖、木五糖、木六糖和木七糖組分純度分別為98.18，88.54，97.52，78.80和86.　　67.

　　（2）低聚木糖混合液中阿拉伯糖基含量為14.75，其中木二糖和木三糖為均質低聚木糖，不含阿拉伯糖基，而木五糖至木七糖中混有帶阿拉伯糖基側鏈的異質低聚木糖。

　　（3）以聚丙烯酰胺凝膠BioGelP2為分離介質，對純度為88.54木三糖組分進行二次分離，其純度可提高到94.19.